​"....Il campione museale di Tragopan melanocephalus ha prodotto DNA degradato e abbiamo ottenuto solo sequenze brevi (375 nucleotidi) di CR-I. Le analisi filogenetiche eseguite utilizzando questo set di dati parziale hanno associato melanocephalus al clade blythii-satyra (Fig. 6A), sebbene con un basso supporto bootstrap; erano possibili anche relazioni alternative di melanocephalus al clade caboti-temminckii o a una politomia basale irrisolta (Fig. 6B,C - link). La topologia mostrata nella Figura 6A era la migliore in termini di verosimiglianza (2log L 5 1.440,57, con GTR 1 g), ma non differiva significativamente dagli alberi alternativi (Fig. 6B,C - link) utilizzando il test di verosimiglianza KH (Tabella 5). Questa topologia era più corta (L 5 223 vs. 237 e 232) e significativamente diversa (P , 0,05) dalle alternative che utilizzavano i test di parsimonia KH e Templeton (Tabella 5 - link). Tuttavia, questa topologia aveva la stessa probabilità e lunghezza di alberi che rappresentavano relazioni filogenetiche alternative tra Tragopan (Johnsgard 1986; Islam e Crawford 1996, 1998; Fig. 6G,H - link). Pertanto, una migliore risoluzione delle relazioni di T. melanocephalus sarà possibile quando saranno disponibili nuovi campioni per un ulteriore sequenziamento del DNA. 

Test di ipotesi filogenetiche alternative.- Johnsgard (1986) ha suggerito che i tragopani erano costituiti dalle superspecie blythii-caboti e melanocephalus-satyra-temminckii in base alle dimensioni del corpo e alla colorazione del piumaggio. Al contrario, sulla base di analisi quantitative delle vocalizzazioni e confronti qualitativi delle esibizioni di corteggiamento, Islam e Crawford (1996, 1998) hanno suggerito che "le specie di tragopani distribuite centralmente (Satyr, Blyth e Temmink) hanno mantenuto le caratteristiche della popolazione ancestrale. . . ." ed erano strettamente correlate tra loro, mentre "le specie periferiche (Western e Cabot) hanno subito modifiche vocali. . . ." ed erano separate in due gruppi distinti. Le diverse filogenesi alla base dei dati morfologici, comportamentali e del mtDNA sono illustrate nella Figura 6 (link) e la significatività statistica delle topologie è stata analizzata utilizzando i test KH e Templeton (Tabella 5 - link). La filogenesi mtDNA (Fig. 6D - lnk) rappresenta la migliore spiegazione dei dati utilizzando l'allineamento totale cit-b 1 CR senza T. melanocephalus. Le topologie alternative proposte da Islam e Crawford (Fig. 6E - link) e Johnsgard (Fig. 6F - link) sono diverse dalla filogenesi mtDNA a P , 0,0001 (Tabella 5 - link). Utilizzando solo l'allineamento breve di 375 nucleotidi incluso T. melanocephalus, le filogenesi alternative (Fig. 6 G,H - link) non erano significativamente diverse dalla migliore topologia mtDNA (Fig. 6A - link)...."

 

Discussione                                                                                                                                                                                                                                                                                          Evoluzione dei geni CR e cyt-b e inferenza filogenetica.- L'evoluzione dei geni mitocondriali è condizionata da peculiari vincoli funzionali che definiscono il numero di siti che sono liberi di variare e il tipo di mutazioni che possono essere fissate, determinando così i loro tassi di divergenza totali (Zardoya e Meyer 1996). In media, CR e cyt b si sono evoluti a tassi simili tra i tragopani e i loro outgroup (fuori dal gruppo) su distanze genetiche che vanno dal 4 al 16% (vedi Fig. 2A, Tabella 2 - link). Questi risultati sono in apparente contrasto con l'evoluzione prevista di CR, che dovrebbe essere più rapida nei primi livelli di divergenza e più lenta a livelli più elevati a causa di un tasso di evoluzione intrinsecamente rapido e di una saturazione dilagante di siti e domini ipervariabili (Zhu et al. 1994, Lyrholm et al. 1996).  Tuttavia, nei tragopani e negli outgroup (fuori gruppo) dei fasianidi in questo studio, cyt b ha accumulato più ti ma meno differenze tv rispetto al CR (Fig. 2B - link). È ben noto che la maggior parte dei ti, in particolare nelle posizioni del terzo codone, sono sinonimi e possono evolversi e saturarsi rapidamente (Irwin et al. 1991). Pertanto, i siti cyt-b che sono liberi di variare tendono ad accumulare ti, che contribuisce alla maggior parte della divergenza nei primi passaggi evolutivi intraspecifici ma potrebbe saturarsi rapidamente (Fig. 3C - link). Il CR evolve in modo piuttosto conservativo, in media, e i siti ipervariabili sono confinati in due brevi regioni in CR-IB e nella parte finale dei domini CR-III (Fig. 4 - link).                                                                                                                                                                                                Le posizioni CR che sono libere di mutare possono accettare più tv rispetto al cyt b, continuando così ad accumulare mutazioni a distanze evolutive maggiori (Fig. 3F- link). Ecco perché, piuttosto sorprendentemente, i CR aviari esprimono un segnale filogenetico sostanziale e possono essere utilizzati per l'inferenza filogenetica in una finestra relativamente ampia di divergenza evolutiva (Kimball et al. 1997, 1999; Kidd e Friesen 1998; Randi e Lucchini 1998).  

I tassi variabili di sostituzione in siti e domini diversi richiedono che vengano utilizzati modelli complessi di evoluzione del DNA per l'inferenza filogenetica delle sequenze di mtDNA (Tamura e Nei 1993, Yang 1996).  

In questo caso, il modello di massima verosimiglianza più adatto aveva il maggior numero di parametri, il GTR. I modelli evolutivi complessi
aumentano la varianza dei parametri stimati e quindi richiedono sequenze più lunghe per aumentare la probabilità di ottenere filogenesi ben supportate (anche se non necessariamente corrette). Le relazioni filogenetiche tra i tragopani possono essere ricostruite in modo affidabile con sequenze più corte, ma l'allineamento combinato cyt-b 1 CR ha prodotto costantemente i valori di supporto internodale più forti (Tabella 4). Nonostante il sospetto aumento di omoplasia in siti e domini ipervariabili, il segnale espresso da CR-IB e ti in terza posizione di cyt b ha contribuito a migliorare la risoluzione della filogenesi del tragopano (vedere anche Kimball et al. 1999).
Sebbene i grafici di saturazione siano spesso utilizzati per determinare siti in rapida evoluzione che hanno maggiori probabilità di essere saturi, la saturazione di per sé non esclude le informazioni filogenetiche.

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Relazioni filogenetiche dei tragopani e implicazioni tassonomiche.- Le sequenze CR cyt-b 1 hanno identificato due cladi univoci in Tragopan, il primo che unisce temminckii e caboti (clade A) e il secondo che unisce satyra e blythii (clade B). Tuttavia, la sequenza parziale CR-I melanocephalus ottenuta da un campione di piume non ha risolto definitivamente le relazioni di questa specie. La filogenesi del mtDNA non era concordante con le due superspecie di Johnsgard (1986), ovvero melanocephalus-satyra-temminckii e blythii-caboti, né con i gruppi di specie centrali rispetto a quelli periferici, ovvero satyra-blythii-temminckii rispetto a melanocephalus e caboti come indicato dalle analisi delle vocalizzazioni e del comportamento (Islam e Crawford 1996, 1998).

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Biogeografia e speciazione nei tragopani.- La topologia dell'albero molecolare si sovrappone all'attuale distribuzione geografica dei tragopani (Fig. 1). Il modello filogenetico osservato è compatibile con un meccanismo di speciazione allopatrica e potrebbe essere stato generato dalla frammentazione di una popolazione ancestrale diffusa o dalla dispersione e divergenza lungo le catene montuose dell'Himalaya e della Cina centrale. Johnsgard (1986) ha postulato l'esistenza di un importante centro di origine della diversità dei fagiani nell'Himalaya orientale e attraverso la Birmania settentrionale e lo Yunnan. Le ipotetiche popolazioni ancestrali potrebbero essere state localizzate in quest'area e poi progressivamente frammentate o disperse, producendo i lignaggi del tragopano occidentale e orientale che si sono diffusi rispettivamente verso l'Himalaya e la Cina centrale e sud-orientale.
I due principali cladi di tragopani divergevano a circa l'8% di distanza genetica cit-b, che avrebbe potuto essere generata in un arco di tempo di circa 4 milioni di anni, assumendo il tasso standard di evoluzione del mtDNA dei vertebrati del 2% per milione di anni (Avise e Walker 1998). Pertanto, la prima divisione evolutiva potrebbe essere stata favorita dalle drammatiche conseguenze del sollevamento improvviso dell'Himalaya meno di 8 milioni di anni fa (Harrison et al. 1992, Abdrakhmatov et al. 1996), che creò una serie di catene montuose parallele che correvano da est a ovest (e da nord a sud in Pakistan e Birmania), inducendo così la prima divisione basale tra gli antenati himalayani e cinesi dei tragopani attuali. L'Himalaya continuò a sollevarsi durante il Pliocene e il Pleistocene e costrinse i principali bacini idrografici fluviali preesistenti a scavare profondi canyon attraverso le valli montane. Le attuali distribuzioni dei tragopani himalayani sono delimitate da alcuni dei principali bacini idrografici fluviali dell'area (Johnsgard 1986); ad esempio, la distribuzione di T. melanocephalus corrisponde al bacino del fiume Indo, T. satyra abita l'intero bacino idrografico del fiume Gange e T. blythii si trova sui lati occidentale (T. b. blythii) e orientale (T. b. molesworthi; noto solo da tre esemplari <?>) del fiume Brahamaputra (Fig. 1).

L'innalzamento dell'Himalaya ha avuto anche importanti conseguenze climatiche (Cracraft 1973). Ad esempio, il caldo clima tropicale dell'altopiano tibetano è cambiato rapidamente e le foreste tropicali un tempo uniformi si sono spostate verso i pendii umidi meridionali e sono scomparse dai pendii aridi settentrionali e dalle valli interne. La diversificazione dell'habitat ha seguito un evidente gradiente verticale e un gradiente est-ovest, con le piogge monsoniche più intense sul versante orientale dell'Himalaya e l'arido ovest (Shaller 1977). Ulteriori importanti cambiamenti dell'habitat nell'Himalaya sono stati prodotti dai cicli glaciali/interglaciali del Pleistocene. Le calotte glaciali si sono espanse nell'Himalaya durante i periodi glaciali con conseguente spostamento altitudinale di steppe e foreste e fluttuazioni cicliche nella distribuzione degli animali. La divergenza della sequenza cyt-b tra le specie sorelle di Tragopan è del 3,6% (clade A) e del 5,9% (clade B), corrispondente a circa 1,8-2,9 milioni di anni di divergenza evolutiva.                              Pertanto, la speciazione in Tragopan potrebbe essere stata favorita da eventi nel Pliocene e nel Pleistocene, che hanno diviso le popolazioni himalayane in melanocephalus occidentale, satyra centrale e blythii orientale e hanno diviso le popolazioni cinesi in temminckii occidentale e caboti orientale.

Selezione sessuale e speciazione nei tragopani.- Un albero filogenetico simile a quello previsto dalla speciazione geografica tramite vicarianza potrebbe anche essere prodotto dalla speciazione parapatrica guidata dalla selezione sessuale. In questo caso, i tratti fenotipici selezionati durante la speciazione parapatrica a causa della selezione sessuale dovrebbero essere filogeneticamente informativi (Brooks e McLennan 1991). 

Tuttavia, questo non è il caso dei tragopani. La mancanza di concordanza tra i modelli filogenetici e la distribuzione dei tratti fenotipici che probabilmente sono soggetti a selezione sessuale è illustrata dalla morfologia della giogaia. Tutti e cinque i tragopani possiedono corna blu gonfiabili e grandi giogaie o bavaglini frontali. In tre specie (satyra, temminckii e melanocephalus) appartenenti a entrambi i rami principali della filogenesi molecolare (Fig. 1), i colori primari che adornano la giogaia sono il blu e rosso (Johnsgard 1986, McGowan 1994:469). In altre due specie (blythii e caboti), che occupano anche rami filogenetici diversi, le giogaie presentano in gran parte gialle o arancioni (sebbene piccole quantità di colorazione blu si verifichino in ciascuna di queste specie).  Data la distribuzione dei modelli di colore, è probabile che inizialmente si siano evoluti il ​​blu e il rosso e che la colorazione arancione/gialla si sia evoluta indipendentemente in ogni lignaggio. Questo modello evolutivo presuppone che una struttura simile a una falda si sia verificata nell'antenato comune delle cinque specie e che, man mano che ogni popolazione si è isolata, le preferenze femminili abbiano selezionato modelli di colore unici che fornissero informazioni sulla qualità di un dato maschio rispetto ad altri maschi. Le falde dei tragopani maschi possiedono caratteristiche che possono segnalare la salute o la qualità del maschio. Ad esempio, se il giallo e il rosso sulle falde di tutte e cinque le specie di tragopani sono basati su pigmenti carotenoidi, allora le falde hanno il potenziale per segnalare la condizione, come si è visto in alcune altre specie aviarie (e. g. Ligon 1999). Inoltre, i modelli di quattro delle cinque specie (tutte tranne blythii) mostrano simmetria bilaterale nel modello di colore. Si presume che quest'ultima, come i carotenoidi, fornisca un segnaletico meccanismo di qualità (Ligon 1999). I lembi di tutti i tragopani, eccetto i blythii, sembrano essere splendidamente progettati per enfatizzare lo sviluppo simmetrico dei motivi cromatici.

Le distribuzioni allopatriche e il modello di relazioni filogenetiche tra i tragopani, insieme alla distribuzione idiosincratica dei tratti fenotipici probabilmente sottoposti a selezione sessuale, forniscono prove contro la speciazione simpatrica. Presi insieme, la filogenesi molecolare, la distribuzione geografica e il comportamento suggeriscono che i tragopani si sono evoluti in allopatria per vicarianza a causa della frammentazione storica e delle barriere estrinseche al flusso genico. Altre specie che si sono evolute negli stessi periodi e che condividono habitat simili dovrebbero essere state influenzate dagli stessi fattori biogeografici che promuovono l'isolamento e la speciazione. Vale la pena notare che Lophophorus impejanus e L. sclateri, strettamente correlati, e Lophura leucomelanos e L. nycthemera, hanno distribuzioni simili ai cladi A e B di Tragopan (Johnsgard 1986, McGowan 1994), indicando che una divisione principale tra le popolazioni di fagiani himalayani e cinesi potrebbe essere stata generata da fattori biogeografici comuni.